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衣原体介绍

衣原体(chlamydia)是一类能通过细菌滤器、有独特发育周期、严格细胞内寄生的原核细胞型微生物。引起人类疾病的有沙眼衣原体、鹦鹉热衣原体及肺炎衣原体三种。

第1节  姬姆萨染色检查沙眼衣原体包涵体

【材料】

1. 玻片。

2. 甲醇、姬姆萨染色液、0.01M pH 7.4 PBS。

【方法】

1. 将取有眼结膜或泌尿生殖道上皮细胞的拭子涂在洁净载玻片上。

2. 用甲醇固定涂片10分钟,用姬姆萨工作液染色30~45分钟,用PBS洗涤2次。

3. 置涂片于显微镜下观察包涵体。

【结果】

姬姆萨染色可见阳性标本片上细胞浆内排列较疏松的包涵体。包涵体内可见许多染成深兰色或暗紫色的衣原体始体颗粒。其形态可见图19-1:




      散在型包涵体       帽型包涵体        桑椹型包涵体       填塞型包涵体  

图19-1    沙眼衣原体包涵体

第2节  免疫荧光法检测沙眼衣原体

【原理】

泌尿生殖道感染衣原体后,经1~3周潜伏期开始出现临床症状,男性表现为非淋球菌性尿道炎、附睾炎、直肠炎、前列腺炎,女性表现为阴道炎、宫颈炎、盆腔炎、输卵管炎、直肠炎等,此时采取尿道或宫颈标本,经抗沙眼衣原体特异性荧光抗体染色,在荧光显微镜下可查见沙眼衣原体颗粒及细胞内包涵体。

【材料】

1.  标本:泌尿生殖道拭子

2.  沙眼衣原体检测试剂盒:包括抗沙眼衣原体荧光标记的单克隆抗体(用时加无菌0.9 %  NaCl 0.5 mL)、吐温-80、缓冲液浓缩液(用时每2 mL母液加1000 mL蒸馏水、NaCl 8.5 g及吐温-80 0.5 mL,即为洗涤缓冲液)、碱性缓冲甘油。

3.  甲醇、载玻片、孵箱、吸管、荧光显微镜等。

【操作】

1.涂片:将拭子上的标本涂在载玻片上,干后放入标本缸中以甲醇固定10分钟,取出后于空气中干燥。

2.加抗沙眼衣原体荧光标记的单克隆抗体,使其覆盖标本,放入湿盒中,置37℃浴箱30分钟。

3.以冲洗缓冲液冲洗,甩干,滴加缓冲甘油,加盖玻片封片,于荧光显微镜下检查。

【结果】

    荧光显微镜下如见亮绿色,边界清晰的圆形颗粒,或柱状细胞内查见亮绿色包涵体,可报告为“沙眼衣原体荧光抗体染色阳性”

第3节  金标免疫斑点法检测沙眼衣原体抗体

【原理】

斑点反应板上的固相CT抗原(D-K型混合抗原)特异性与血清中CT抗体结合形成复合物,胶体金标记的抗人IgG抗体再与复合物结合,形成肉眼可风的红色圆斑。

【材料】

1.  病人血清

2.  金标免疫斑点法检测沙眼衣原体抗体试剂盒

试剂盒组成:

⑴ 斑点反应板
 40块
 
⑵ 试剂A
 1 瓶
 
⑶ 试剂B
 1 瓶
 
⑷ 标本吸管
 40支
 
⑸ 阳性对照卡
 一张
 

【操作方法】

1.  自冰箱中取出试剂盒,并平衡至室温。

2.  加试剂A 2滴于反应板孔中,待液体充分渗入。

3.  用样品吸管加样品0.15 mL(4滴)于反应板孔中,待液体充分吸入。

4.  去除蓝色过滤盖。

5.  加试剂B 3滴于反应板孔中,待液体充分吸入。

6.  加试剂A 1滴~2滴于反应板孔中,待液体吸入后观察结果。

【结果】

如反应孔中仅出现红色控制线,无红色斑点时,判为沙眼衣原体抗体阴性。如反应孔中出现红色控制线及红色斑点时,判为沙眼衣原体抗体阳性。如反应孔中既无红色控制线又无红色斑点时,说明试剂失效,需更换试剂重新操作。

第4节  细胞培养分离衣原体

由于衣原体缺乏代谢酶,致使它在无生命的培养基上不能生长,只能使用细胞培养才能进行该病原体的分离。

【材料】

1.  McCOY细胞

2.衣原体标本运送培养基、细胞生长培养基(见附录),磷酸盐缓冲液(PBS),       放线菌酮(一种抗代谢药物,可以抑制真核细胞代谢而不抑制原核细胞生长繁殖,从而有利于衣原体繁殖)。

3. 平底细胞培养瓶,吸管、毛细吸管。

【方法】

1. 标本的采集和运送:标本中必需含有上皮细胞,因为衣原体是在细胞内增殖。含1 mL运送培养基的小试管内放有2~3颗无菌小玻璃珠。采集标本的拭子放入试管内,将病人标本洗到运送培养基中,拭子经灭菌处理后适当处理。小试管用冰壶带回实验室。将试管置震荡器上,猛烈震荡20秒,使感染细胞破碎,释放出原体。可立即接种或置-70℃冰箱保存,接种时快速融化。

2. 制备单层McCOY细胞管:McCOY细胞在组织培养瓶中生成致密单层,经0.25%胰酶消化后,加入细胞生长液,配成约含1×105细胞/mL的细胞悬液,吸取1 mL分装于细胞培养小瓶中,瓶底预先置一约12mm×12mm的盖玻片,在CO2培养箱中37℃培养24~48小时,使细胞在盖玻片上形成单层。

3. 接种标本:取已生长好的McCOY细胞管,吸去上清,每管加入1 mL细胞生长液及0.2 mL悬液,2000~3000 rpm离心1小时,促使衣原体进入细胞,然后置5% CO2温箱中1 ~2小时。吸去上清,加入含1 μg/mL放线菌酮的营养液,置37℃ 5% CO2培养箱中培养48小时。

取出盖玻片,用PBS洗2~3次,风干,用无水甲醇固定后,用于碘染色(包涵体呈棕褐色)或姬姆萨染色,或用丙酮固定后用荧光抗体染色,结果观察同前所。
发布时间:2011年6月14日

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